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清華大學曲久輝院士團隊Angew:物理抽提磷脂協同自由基氧化實現病原微生物高效滅活

時間:2021-03-11 14:00

來源:曲久輝院士團隊

評論(

  成果簡介

  目前,世界各地醫院和社區中的各種細菌感染正構成嚴重的公共健康和環境健康風險。為解決這些問題,我們研究了一種創新的基於納米片細菌滅活系統的“毒箭頭”消毒方法,利用二維MoS2的“箭頭”構型從細胞膜中有力地提取脂質並隨後使膜破裂。在強氧化劑過硫酸鹽(PMS)的存在下,MoS2的硫空位激活了穩定的分子,進而從邊緣位置到基底區域產生活性氧物種。這一過程不僅清除了部分磷脂以實現MoS2表面的更新,同時直接攻擊蛋白質,對受損細胞造成進一步損傷,增強病原微生物的受損細胞膜的壓力。少量納米片材料存在下,可實現30s內對天然水進行消毒(按細菌總數計算,滅活率為99.93%)。

  引言

  目前,已出現包括非均相芬頓、光電催化在內的多種高級氧化技術應用於水中細菌的滅活。自由基攻擊細胞膜,改變其高分子結構,誘發通透性變化,造成細胞內必要的酶外泄,細菌由於無法完成新陳代謝、有絲分裂等生命活動而被滅活。雖然自由基能夠氧化細胞膜的各種成分,但由於細胞膜的成分組成主要是磷脂、蛋白、多糖等高分子有機物,所以氧化過程需要大量自由基,這就導致了以自由基為主的消毒方式的停留時間比較長。作為典型的二維納米材料,MoS2顯著的細胞毒性來源於靜電效應和硫脂之間的範德華力。由於負硫位點易與脂類中親水頭部結合,MoS2的納米邊緣可以切割細胞膜,促進膜中磷脂的提取,從而導致膜破裂和細菌細胞死亡。然而,隨着納米片表面有效活性位的迅速被佔據,二維納米材料喪失對病原微生物的滅活能力。因此,對於納米材料物理殺菌過程,應考慮如何恢復納米材料殺菌性能,使其保持持續殺菌能力。為了緩解自由基氧化的負荷,結合納米材料的物理殺菌過程,我們創新提出納米材料殺菌的理化協同機制:納米材料對細菌的物理損傷降低了自由基氧化的負荷,同時自由基能夠清潔納米材料表面,促使納米材料恢復物理殺菌的性能,理化過程相互促進和補充,共同實現水中致病菌的快速滅活(圖1a)。

  圖文導讀

  初步比較了不同濃度的PMS的存在下MoS2納米片的抗菌活性(圖1b)。在無PMS存在下,由MoS2作用60min後,對大腸桿菌的殺菌效率約為~0.34(對數去除率)。此外,PMS具有化學氧化抑菌能力,在25℃下將E.coli和10mg/L的PMS溶液共同培養60min後,E.coli滅活率達到94%,此外,MoS2/PMS體系明顯提升了E.coli滅活效率,共同培養60min後,體系中E.coli的滅活率達到>99.9986%。此外,如圖1c所示,通過Alamarblue試劑盒對不同殺菌體系的新陳代謝水平評價可知,MoS2/PMS體系對E.coli的新陳代謝抑制高達97.0%,幾乎徹底殺滅所有E.coli。而物理殺菌體系對E.coli新陳代謝的抑制和MoS2濃度正相關,在MoS2濃度分別為10μg/L,25μg/L和50μg/L時,新陳代謝抑制分別達到11%,24%和36%,證實了物理損傷和ROS氧化之間的協同作用可能導致優異的抗菌性能。

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  圖1. a.物理-化學協同強化病原微生物滅活機制圖;b-c.MoS2、PMS和MoS2/PMS系統的消毒性能和大腸桿菌活性比較

  為了深入研究理化協同機制,我們首先製備了不同含硫空位的MoS2納米片(圖2a-b),並明確了MoS2納米片對E.coli的物理損傷過程(圖2c)。不同物理損傷階段的E.coli的切片透射電鏡圖和掃描電鏡圖如圖2c所示。第一階段是鮮活的E.coli的切片,其邊緣清晰,厚度約10nm,複合磷脂雙分子層的理論厚度;細胞質飽滿,可明顯看到膠質填充滿的細胞結構。隨着MoS2和E.coli接觸時間的延長,細胞膜的形態達到第二階段,大量MoS2接觸E.coli細胞膜,細胞膜邊緣顏色變淺,部分區域的細胞膜“攤開”成一片。這一步主要發生了磷脂的抽提,MoS2在接觸細胞膜後,通過靜電吸引和分子間作用力將磷脂分子從細胞膜中抽提至MoS2表面,隨着抽提的進行,細胞膜逐漸變薄,有些區域的磷脂和MoS2混在一起。細胞膜形態在長時間磷脂抽提後達到第三階段,大規模長時間的磷脂抽提已經扭曲了細胞膜的原始外形,抑制了E.coli有絲分裂增殖,此外,可明顯看出細胞質流失,E.coli由於缺少新陳代謝酶而最終滅活。

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  圖2. a.二維MoS2納米片的HAADF-STEM圖像;b.原子水平的MoS2結構的偽色彩圖像;c.MoS2條件下活大腸桿菌和死大腸桿菌的形態;d. 暴露於不同濃度MoS2懸浮液的大腸桿菌細胞釋放的LDH含量;e.MoS2納米片在300 K下從POPE脂質膜中提取脂質的過程;f.MoS2納米片底部與脂質中的磷原子在300 K之間的z位置信息;g.細胞膜和MoS2納米片的相互作用能隨時間的演化

  隨後,通過分子動力學模擬能夠更細緻深入的揭示物理抽提過程,在建模之前,通過HPLC-HRMS準確測定了E.coli細胞膜的磷脂組成及比例。如圖2e所示,磷脂組學揭示了E.coli細胞膜中的主要成分,磷脂酰乙醇胺(PE)佔總磷脂的比例為83.7%,磷脂酰甘油(PG)比例為14.2%,心磷脂(CL)比例為2.12%,其餘為極少量的溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)。而在PE中,以sn1:sn2=16:0/18:1的1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)為主,如圖2f所示,POPE佔全體PE的比例高達21%。高分辨質譜結果為MD模擬建模提供了理論依據,在MD建模時,磷脂分子層的模型被建立為雙層POPE。無缺陷的MoS2入侵細胞膜的分子動力學模擬如圖2g所示,經過約100ns的自由運動到達POPE膜表面,其邊緣首先和POPE分子接觸,促使POPE膜發生微弱的形變,隨着接觸時間的延長,在靜電吸引和分子間作用力的趨勢下,MoS2納米片不斷變換位置,開始從磷脂層中抽離POPE分子。幾百納秒後,細胞膜上的磷脂疏水尾巴很容易鋪展到整個MoS2上,導致在TEM圖像中出現大量的膜皺紋。

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  圖3 a. MoS2/PMS系統中ROS生成的熒光成像;b.利用EPR光譜測定ROS;c.LSCM明長模式觀察PMS激活過程中MoS2的形態變化;d.離心獲得上清液或消化上清液中磷酸鹽的濃度;e.MoS2/PMS系統中死大腸桿菌的形態

  隨着MoS2表面被磷脂分子完全覆蓋,納米片逐漸失去了對大腸桿菌造成物理損傷的能力。結合MoS2較強的活化PMS產自由基反應過程,我們提出以自由基為活性中間體去除MoS2納米片表面負載的磷脂,以此加速病原微生物細胞凋亡。首先,採用香豆素作為探針檢測PMS激活產生的ROS(圖3a),發現PMS的加入可以使體系的熒光強度顯著增強,證實了有效的PMS激活位點發生在基底和邊緣處。隨後,自旋捕捉電子順磁共振譜的證實了MoS2/PMS體系中ROS的有效產生(圖3b-c)。為了深入瞭解自由基氧化的作用,我們進一步研究了磷形態在滅菌過程中的演變過程(圖3d)。與單一物理抽提或化學損傷相比,協同滅菌過程中磷從磷脂向水溶液的轉移過程明顯增強。基於此,我們提出了物理-化學協同的病原微生物滅活新機制:物理損傷抽提磷脂並減薄細胞膜,降低ROS氧化負荷;化學氧化除自身氧化細菌的細胞膜磷脂外,“清潔”已被MoS2抽提的磷脂分子,恢復MoS2抽提能力。

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  圖4a. 垂直生長於碳布上MoS2的FE-SEM圖像;b.MoS2尖鋭邊緣的HAADF-STEM圖像;c.僅在PMS,SMCS/ PMS和SMCS/ PMS / TBA系統中產生ROS的EPR光譜;d.自制過濾器支架的示意圖;e.SMCS的殺菌性能;f.將SMCS/ PMS系統與可比的消毒系統的殺菌性能的比較;g.活細菌和死細菌細胞的暗場熒光顯微鏡檢查

  隨後,我們設計並製作了垂直生長於碳布的MoS2陣列(SMCS)。垂直生長的MoS2裸露了其鋒利邊緣,不僅可強化對細菌的物理損傷(圖4a-b),還能保障ROS的穩定輸出(圖4c)。在中性條件下,PMS投加量高於100mg/L時,對細菌菌落數低於106CFU/mL的廢水具有較好的消毒能力,可在不到1min內高效殺菌,其動力學高於以光電為主的各種消毒工藝。以此為核心組件,我們隨後組建了針對天然水體消毒的反應器(圖4d)。該處河水的總菌羣數約為3×105CFU/mL,在[PMS]=100mg/L,河水總菌羣去除率達99.94%。

  小結

  本研究通過一種新的物理化學協同機制展示了MoS2納米片對微生物的快速滅活。主要結論如下:

  (1)在PMS分子(10mg/L)存在下,帶有硫空位的MoS2納米片(10mg/ L)脱落表現出對大腸桿菌(107CFU/mL)約99.999%抗菌性能。

  (2)2DMoS2納米片中的非硫空位區(SVs-freearea)通過脂質提取破壞了大腸桿菌的膜,起到了“刀片”的作用。同時,MoS2上的硫空位區在PMS的存在下產生ROS,攻擊損壞的脂膜,並清除不含硫空位的MoS2區域中負載的脂質分子,從而強化殺菌性能。MoS2中位點的這種“刷新”機制確保了對細胞膜的破壞作用的連續性,因此協同提取和氧化進一步放大了細胞膜破壞壓力,並導致各種細菌的高致死率。

  (3)採用該協同提取和氧化的消毒策略,可在超短時間內實現天然水的消毒,總細菌滅活率達99.94%。

  主要作者介紹

  陳瑀,博士畢業於中國科學院生態環境研究中心,現任清華大學水質與水生態研究中心博士後 (導師:曲久輝院士),研究方向為高級氧化水處理技術與原理。迄今,以第一作者身份在Angew. Chem.-Int. Edit.,ACS appl. Mater. Inter.等國際期刊發表SCI 3篇。

  張弓,博士畢業於中國科學院生態環境研究中心,清華大學環境學院助理研究員。主要研究領域:(1)電化學水處理新技術與原理,(2)電化學污染物降解與同步產能。迄今,在Energy Environ. Sci.,J. Am. Chem. Soc.,Angew. Chem. Int. Edit.,Environ. Sci. Technol.等環境、化學權威期刊發表論文60餘篇,SCI引用總計2000餘次(H因子21)。獲授權中國發明專利8項,國際發明專利1項;曾獲中國科學院院長特別獎,入選中國科協“青年人才託舉工程”。

  曲久輝,環境工程專家,中國工程院院士、發展中國家科學院院士、美國國家工程院外籍院士,清華大學環境學院特聘教授,中國科學院生態環境研究中心研究員。主要從事水質科學與工程技術研究,重點關注飲用水水質風險控制、受污染水體生態修復等方面的理論探索、技術創新和工程應用。已在國內外學術期刊發表研究論文400餘篇,其中SCI論文300餘篇,獲授權中國、美國、歐洲等中國和國際發明專利80餘項,2014年當選國際水協(IWA)Distinguished Fellow。曾兩次獲得國家科學技術進步二等獎及國家技術發明二等獎,2009年獲得何梁何利科學技術進步獎,2010年分別獲得全球和東亞地區IWA創新項目獎等。

編輯:王媛媛

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